Prof. Mariano Levin y Dr. Hernán García Rivello.
INGEBI. Vuelta de Obligado 2490.
Correo electrónico: mlevin@dna.uba.ar
La biología y la medicina iniciaron un cambio profundo, cuando hace más de diez años comenzó el proyecto que se propone caracterizar hasta en su mínimo detalle el juego completo de instrucciones genéticas del ser humano, el Proyecto Genoma Humano (PGH).
Hacia fines de los años 80, la motivación central del PGH era obtener la lista de los genes cuyas versiones mutadas inducen una enfermedad genética. Este objetivo pronto dió paso a formular el PGH en su verdadera magnitud, obtener el listado completo y localizar los 80.000 genes dispersos en el océano de los 3.000.000.000 de pares de bases (pb) que componen el genoma humano.
Los planes iniciales preveían la finalización del proyecto hacia fines de la primera década del nuevo milenio, pero en 1994, por la implementación de la automatización de diferentes procesos del laboratorio genómico, entre ellos la secuenciación del ADN, se acortó el plazo al 2005. La dinámica del proceso y los primeros resultados del PGH aumentaron las expectativas y concitaron un creciente apoyo por parte de las agencias estatales y los grupos privados. No es para menos, puesto que en los últimos años se detectaron aproximadamente 1500 genes cuyos defectos están directamente implicados en el origen de las 200 enfermedades genéticas más frecuentes y en otras 700 enfermedades genéticas. En la mayoría de los casos se logró rastrear la mutación causal, lo que trajo aparejado un sustancial aumento de la capacidad de diagnóstico (2). También se han descubierto nuevos mecanismos fisiopatológicos, como la expansión de las repeticiones de tripletes (3) y las deficiencias en los mecanismos de reparación del ADN causantes de numerosos procesos neoplásicos como el adenocarcinoma de colon hereditario sin poliposis (4). Todo esto condujo al desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico y tratamiento y al descubrimiento de nuevas alteraciones genéticas relacionadas con este tipo de defectos (1, 2, 5, 6).
Debido al rápido desarrollo de los proyectos de secuenciación del sector privado y estimulados por el constante aumento en la demanda de datos de secuencias génicas, los EEUU, Gran Bretaña y Francia reformularon en 1998 sus objetivos y propusieron completar la secuencia del genoma hacia el año 2003. Se incluyó un paso intermedio, la concreción hacia mediados del año 2000 del 90% de la secuencia "borrador" del genoma humano. Las secuencias "borrador " o working draft serán de utilidad para encontrar genes relacionados con diferentes patologías, pero no será tan útil como la secuencia completa y revisada que se conocerá en el 2003.
Existe un acuerdo generalizado, tanto en el sector público como en el privado de los EEUU y del resto de los países desarrollados, en que la secuencia final tiene que ser exacta y de libre acceso. En el marco de los proyectos estatales, sobre todo el de los EEUU, esto se garantiza por una reglamentación que obliga al inmediato depósito de las secuencias obtenidas por los laboratorios financiados estatalmente en el GenBank, al que se accede en http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Esta base de datos es centralizada por el National Center for Biotechnology Information de EEUU (Bethesda, Maryland). El GenBank recibe más de 200.000 pedidos de información sobre secuencias por día. La magnitud y la velocidad del secuenciamiento en el marco del PGH y otros proyectos relacionados es tal que, en los últimos 15 meses, se depositaron en el GenBank más de 2.000.000.000 de pares de bases (pb) de secuencia. Entre ellas se encuentran más de 1.800.000.000 de pb del PGH, los 53 millones de pb del cromosoma 22 (7) y la totalidad de las bases que constituyen el cromosoma 21 (8).
En contra de una creencia generalizada, el PGH recién comenzó a secuenciar masivamente en el año 1998. Hasta ese momento su actividad estuvo centrada en la construcción de dos tipos de mapas: el mapa genético y el mapa físico del genoma.
El mapa genético localiza una serie de secuencias marcadoras, como los microsatélites (uno con respecto a otro y con respecto a un gen defectuoso). De esta manera, se puede determinar la región cromosómica que contiene un gen mutado que se hereda de acuerdo con las leyes de Mendel. Ya en 1994 el mapa genético del PGH contenía 6000 marcadores ubicados a menos de 1.000.000 de pb uno de otro (9).
El mapa físico se compone por la superposición de fragmentos de ADN genómico clonado y representa la ubicación real de un marcador genético sobre la molécula de ADN. Así, el mapa físico más completo es la secuencia completa de la molécula de ADN de cada cromosoma. Una vez que los marcadores genéticos definen una región cromosómica donde se encuentra un gen mutado, el ADN que la compone puede ser aislado directamente de los fragmentos genómicos clonados y ordenados del PGH. Este mapa contiene mas de 41,000 marcadores definidos por una secuencia corta de ADN denominada STS (sequence-tagged sites) que sirven para alinear y ordenar los fragmentos genómicos mencionados. Con esta frecuencia de marcadores es posible encontrar un determinado gen a no menos de 100,000 pb de un determinado STS (10).
El grueso de los marcadores genéticos y de los STS es anónimo, es decir, define regiones cercanas a un gen, pero no necesariamente el gen mismo. Por esta razón también se construyó un mapa para ubicar los 80.000 genes humanos representados por un tipo especial de marcadores que se denomina EST (expressed sequence tags). Hasta el momento se han ubicado 30.000 genes. Esto significa que hoy, cualquier investigador que busque genes en una determinada región cromosómica, tiene ya una lista bastante completa de los mismos.
Toda la información del PGH debe considerarse como una herramienta para aislar genes por clonado posicional (11). Este método permite aislar un gen relacionado con una enfermedad genética, sin saber qué función cumple. Este tipo de trabajo duraba muchos años en las décadas anteriores; hoy el PGH le permite encontrarlo en pocas semanas. En esta búsqueda, llamada clonado posicional del candidato, (12) juega un papel muy importante el mapa de ESTs, que permite ubicar genes en una región delimitada por marcadores genómicos y STS.
El aislamiento posterior del gen provee la información para comprender las bases moleculares de una patología determinada.
Un ejemplo de este tipo de clonado es el aislamiento de los genes de la enfermedad de Parkinson. En un estudio sobre una familia con la enfermedad de Parkinson con presentación clínica temprana, se ubicó en una porción del cromosoma 4 a la región implicada en esta enfermedad (13). La región contenía aproximadamente unos 100 genes y entre ellos uno que codificaba para la proteína alfa-sinucleína. En pocos meses se logró determinar que una mutación en este gen causaba la enfermedad. Este estudio condujo a investigar otras familias en las que se encontraron mutaciones en genes de los sistemas proteicos relacionados con los mecanismos de degradación de la alfa-sinucleína (14,15).
Si bien estas familias no representan todo el espectro de la clínica de esta enfermedad, estos estudios señalaron nuevos mecanismos fisiopatológicos, ya que la alfa-sinucleína forma parte de los cuerpos de Lewis, presentes en todos los pacientes con Parkinson. El estudio de los procesos proteolíticos en el tejido cerebral puede ofrecer nuevas vías para la investigación de futuras terapéuticas de patologías neurológicas como la enfermedad de Parkinson y de patologías degenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la corea de Huntington, y la ataxia espino cerebelosa (1, 2).
Este es un claro ejemplo de cómo un descubrimiento relacionado con una enfermedad genética es su aplicación tiene una rápida aplicación al diagnóstico médico.
En muchos casos, un diagnóstico precoz permite iniciar tratamientos o estrategias que reducen riesgos y/o previenen la enfermedad (1). Al respecto, son indicativos los casos de las enfermedades como la hemocromatosis, la fenilcetonuria, y la hipercolesterolemia familiar (1). Algo semejante ocurre con ciertos procesos neoplásicos hereditarios.
Es muy probable que en un futuro no muy lejano, y merced al conocimiento de las bases moleculares de la enfermedad, algunas enfermedades actualmente sin tratamiento, sean pasibles de ser tratadas con terapias génicas.
Nuevos y mejores marcadores polimórficos
El conocimiento de más del 10% de la secuencia del genoma humano, y los estudios sobre polimorfismo de marcadores genéticos en diferentes poblaciones humanas, permiten aumentar la definición de los mapas genéticos actuales. Un nuevo tipo de marcador genético polimórfico llamado polimorfismo de un nucleótido (single-nucleotide polymorphism , SNP) ha demostrado su utilidad. Estos SNP ocurren frecuentemente en el genoma. Existe un SNP cada 1.000 pb aproximadamente (16).
Si bien la mayoría de los SNPs ocurren fuera de la región codificante de los genes, algunos contribuyen directamente a la patología por la alteración de una base en la región codificante de un gen y por la alteración generada en la proteína correspondiente. Los SNPs son la base de nuevos desarrollos en el terreno de la farmacogenómica y para el descubrimiento de nuevos caracteres asociados con enfermedades. Actualmente existen emprendimientos públicos y privados para localizar más de 300.000 SNPs del genoma humano en los próximos 3 años (17).
Los SNP y los ESTs proveen la base para confeccionar un detallado mapa genético de cada individuo. La posibilidad de evaluar la variación individual en un solo ensayo genético, es decir, determinar la variación de por lo menos 20.000 SNPs en cada individuo, es factible gracias a los desarrollos en el campo de la microelectrónica aplicada a la genética molecular. El desarrollo recibe el nombre de chip genético, y tiene el tamaño de una estampilla en la cual se imprimen hasta 400.000 secuencias de ADN diferentes de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, que son inmovilizadas en una superficie sólida por técnicas de fotolitografía, semejantes a las utilizadas en la construcción de semiconductores. Un conjunto de sondas que abarcan la variabilidad genómica de un individuo, se harán reaccionar con el chip y permitirá obtener un patrón de hibridación que representa su perfil genómico. Éste se analiza en un lector confocal integrado con un procesador electrónico (18).
Este análisis múltiple de marcadores individuales permitirá, no sólo continuar el análisis de las enfermedades genéticas monofactoriales, sino también comenzar con mayores posibilidades de éxito el análisis de enfermedades multifactoriales.
Referencias:
1. Collins FS. Shattuck Lecture. Medical and societal consequences of the Human Genome Project. N Engl J Med. 1999; 341: 28.
2. Van Ommen GJ, Bakker E, Den Dunnen JT. The human genome project and the future of diagnostics, treatment, and prevention. Lancet 1999; 354 (suppl I): 5.
3. Plassart E, Fontaine B. Genes with triplet repeats: a new class of mutations causing neurological diseases. Biomed Pharmacother 1994; 48: 191.
4. Wallis Y, Macdonald F. The genetics of inherited colon cancer. J Clin Pathol: Mol Pathol 1996; 46: M65.
5. Cairns P, Sidransky D. Molecular methods for the diagnosis of cancer. Biochimica et Biophysica Acta 1999; 1423: C11.
6. Kolodner R, Marsischky. Eukaryotic DNA mismatch repair. CO Genetics development 1999; 9: 89.
7. Dunham I, Shimizu N, Roe BA y col. The DNA sequence of human chromosome 22. Nature 1999; 402: 489.
8. Hattori M, Fujiyama A, Taylor TD y The chromosome 21 mappring and sequencing consortium. Nature 2000; 405: 311-319.
9. Murray JC, Buetow KH, Weber JL. A comprehensive human linkage map with centimorgan density. Science 1994; 265: 2049.
10. Deloukas P, Schuler GD, Gyapay G. A physical map of 30000 human genes. Science 1998; 282: 744.
11. Collins FS. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nat Genet 1995; 9: 347.
12. Jang W, Chen HC, Sicotte H, Schuler GD. Making effective use of human genomic sequence data. Trends Genet 1999; 15: 284.
13. Polymeropoulos MH, lavedan C, Leroy E. Mutation in the alpha synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science 1997; 276: 2045.
14. Leroy E, Bvoyer R, Auburger G. The ubiquitin pathway in Parkinson’s disease. Nature 1998; 395: 451.
15. Ueda K, Fukushima H, Masliah E. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 11282.
16. Schafer AJ, hawlins JR. DNA variation and the future of human genetics. Nat Biotechnol 1998; 16: 33.
17. Wang DG, Fan JB, Siao CJ. Large scale identification, mapping and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 1998; 280: 1077.
18. Khan J, Bittner M, chen Y, Meltzer P, Trent J. DNA microarray technology: the anticipated impact on the study of human disease. Biochimica et Biophisica Acta 999; 1423: M17.