Microsatélites: Son secuencias de ADN de longitud variable (generalmente cortas) constituídads por uno (mononucleotídicos) o dos (dinucleotídicas) nucleótidos que se repiten un número variable de veces. Se hallan repartidos en múltiple número de copias por todo el genoma (en todos los cromosomas) y pueden encontrarse dentro o fuera de los genes. Ejemplo de microsatélite mononucleotídico: (A)10 (una secuencia de 10 Adeninas repetidas). Ejemplo de microsatélite dinucleotídico: (CA)n (una secuencia CA repetida n número de veces, usualmente 15 a 30 veces)

Antes las secuencias repetidas de 3, 4 o 5 nucleótidos se consideraban cortas repeticiones en tandem, pero la diferencia es semántica y hoy en día se engloban también dentro de los microsatélites.

Inestabilidad de Microsatélites (IM): Las polimerasas de ADN durante la replicación "patinan " sobre las secuencias repetitivas (como los microsatélites), generando que la hebra replicada varíe en el número de repeticiones con respecto a la hebra molde.

Este error replicativo es reparado por los sistemas de reparación de errores de apareamiento (mistmach repair genes o MMR genes).

La inestabilidad de los microsatélites está dada por la falla funcional de los genes de reparación del ADN alterados como se ve en los pacientes con Carcinoma Colorrectal Hereditario Sin Poliposis (CCHSP). Esta inestabilidad consiste en la gran variabilidad en la longitud de las repeticiones de secuencias en los microsatélites y puede ser detectada mediante técnicas de biología molecular. Por el contrario en las células normales (sin fallas en los genes MMR) la longitud de las repeticiones microsatelitarias son constantes.

75 a 100% de los carcinomas colorrectales en pacientes con CCHSP tienen inestabilidad de microsatélites.

Conocidos como "mismatch repair genes", codifican proteínas (enzimas) que intervienen en uno de los mecanismos de reparación del ADN genómico, que consiste en detectar y reparar errores en el apareamiento de las dos hebras del ADN por falta de complementariedad en sus secuencias. Estas fallas de apareamiento generan pequeños bucles en una de las hebras del ADN y son debidos a que una de las dos hebras tiene secuencias repetidas sobrantes interpuestas, que la otra hebra no tiene. Estos errores son comunes en las zonas muy repetitivas del ADN y son generados por el "patinado" de las polimerasas de ADN.

hMSH2: gen MMR (Human Mut S homolog 2, por homología con el gen de reparación MUT S de la E. coli), de 909 aminoácidos, ubicado en 2p22 : cromosoma 2, brazo corto (p) región 2, banda 2 (técnica de bandeo cromosómico G)

hMLH1: gen MMR (Human Mut L homolog 1, por homología con el gen de reparación MUT L de la E. coli), de 756 aminoácidos, ubicado en 3p21

hPMS1: gen MMR (Otro homólogo a MUT S), de 932 aminoácidos, ubicado en 2q31-33.

hPMS2: gen MMR (Otro homólogo a MUT S), de 862 aminoácidos, ubicado en 7p22.

GTBP /p160 /hMSH6: gen MMR (Homólogo a MUT L), de 1360 aminoácidos, ubicado en 2p16

hMSH3: gen MMR (Otro homólogo de MUT S), de 1137 aminoácidos, ubicado en 5q11-5q12

PCR: Acrónimo para la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, desarrollada por Mullis y en la Cetus Corporation en los años, es la técnica de amplificación selectiva de ácidos nucleicos más difundida y que ha revolucionado las aplicaciones diagnósticas de la biología molecular. Consiste en utilizar dos cebadores o primers (pequeños oligonucleótidos) para flanquear una secuencia de ADN doble cadena de interés, para luego en presencia de nucleótidos, buffers adecuados, cloruro de magnesio y agua permitir que una polimerasa de ADN termoestable (proveniente de bacterias termófilas) copie la secuencia flanqueada partiendo de ambos extremos de los cebadores. Para ello se requieren

3 pasos : desnaturalización a aprox. 94 ºC, para abrir la doble hélice del ADN a amplificar; annealing o apareamiento de cebadores a 45-70 ºC para permitir que los cebadores reconozcan, por complemetariedad de secuencias, la zona del ADN a amplificar y se hibriden con ella; y extensión a 72ºC, que es el momento en el cual la ADN polimerasa copia ambas cadenas partiendo de los cebadores. Estos pasos se repiten unos 40 ciclos con lo cual se produce una amplificación exponencial (2⁴⁰ veces) del fragmento de ADN en estudio. Luego por técnicas de electroforesis en geles se puede separar y caracterizar dicho fragmento.

Cebadores (primers): pequeñas secuencias de ADN oligonucleotídicas (de 15 a 30 nucleótidos de longitud) que se utilizan para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos fragmentos permiten identificar y flanquear la región del ADN que se desea estudiar por complementariedad de secuencias (hibridan con dicha región, flanquéandola). Además permiten que la reacción de síntesis ocurra, ya que la polimerasa de ADN no puede copiar una hebra molde simple cadena "de novo", sólo puede agregar nucleótidos a partir de un extremo de un cebador (presintetizado) que este apareado en doble hélice con la hebra molde.

Análisis fluorecente multicolor con Secuenciador Automático: esta metodología permite analizar simultáneamente los productos de PCR de varias amplificaciones (en este caso varios microsatélites a la vez). Cada cebador 5´ (uno de los dos que flanquean la secuencia de interés) se halla marcado con un fluorocromo diferente y por lo tanto, el producto de amplificación (de PCR) de cada loci microsatelitario tendrá incorporado un primer con un fluorocromo particular. El secuenciador automático es capaz de realizar las electroforesis de los productos de PCR microsatelitarios en un gel de poliacrilamida de muy alta resolución en corto tiempo, y separarlos por tamaño en bandas discretas (cada alelo con diferentes repeticiones, tendrá diferente longitud y PM). Luego mediante un láser puntual y células fotoeléctricas puede leer las posiciones relativas en el gel de los diferentes productos de PCR y su cantidad relativa a través de la fluorescencia emitida por cada una de las bandas del gel. Genera así un gráfico de dos ejes que informa tamaño del microsatélite amplificado (longitud) en función de concentración del mismo (intensidad de fluorescencia) para cada uno de los microsatélites estudiados.

Pérdida de Heterocigosidad (LOH): Nuestras células portan dos copias de cada gen, una en cada uno de los cromosomas homólogos. Cuando un individuo multicelular hereda una mutación en un alelo de un gen supresor de tumores, se dice que es heterocigota para dicho gen, es decir que tiene una copia mutada (alelo mutado) y una copia normal (alelo normal).

Dicha mutación se halla en todas sus células (somáticas y germinales) ya que es heredada.

Los genes supresores de tumores normalmente cumplen funciones de freno en la proliferación celular (control negativo del ciclo celular) o funciones en la salvaguarda de la información genómica como los genes MMR. Para que un defecto de un gen supresor se evidencie deben perderse o alterarse ambas copias del gen, ya que si sólo se altera una copia, el otro alelo produce proteína normal y suple la función supresora.

Cuando en una célula somática con una mutación heredada de un gen supresor ocurre una segunda mutación en el otro alelo, ambos quedan mutados, perdiéndose totalmente la función de la proteína normal, y evidenciándose la falta se función supresora. Entonces se habla de pérdida de heterocigosidad, ya que ambos alelos quedan mutados, y por lo tanto la célula o células que deriven de ella serán homocigotas (ambos alelos mutados).

Este mecanismo se conoce con el nombre de hipótesis de 2 golpes de Knudson y fue descripta para el gen del Retinoblastoma que codifica la proteína p105 Rb.

Es un mecanismo de recesividad a nivel celular (se requiere que ambos genes muten para perder la función).

No tiene nada que ver con el patrón de herencia del primer alelo mutado a nivel individuo completo (la mutación en línea germinal), que en esta caso es dominante.

Fenotipo de error replicativo (RER+): Es el fenotipo a nivel celular dado por la falla en los Genes de Reparación de Errores de Apareamiento Replicativos (MMR genes) y que puede evidenciarse por Inestabilidad de Microsatélites.

Polimorfismo génico: Variación "normal" en la secuencia de bases codificante (exónica) de un gen que no produce patología per-se, pero que puede determinar que la proteína sintetizada tenga más o menos afinidad por otras proteínas, o modificar ligeramente su actividad cuantitativamente en ciertas condiciones, lo cual puede ser favorecedor (predisponente) o protector para una determinada patología, ante determinada influencia ambiental (virus, carcinógenos físicos o químicos, etc).

Por ejemplo: un polimorfismo especial del gen de p53 favorece la afinidad de la proteína E6 del virus HPV 16 por la p53. Entonces el virus bloquea mucho más fuertemente la acción supresora del ciclo celular por p53, que con otras p53 sin el polimorfismo. Por ello, se favorece la ventaja proliferativa de las células infectadas, y la capacidad oncogénica del virus. Sin embargo las personas que portan el polimorfismo, no padecen de patología alguna per-se, si no se infectan con el virus HPV 16.

Mutación de línea germinal: Mutación (alteración de la secuencia de bases del ADN, traducibles en una alteración en la proteían codificada) que se halla presente en todas las células del individuo (somáticas y germinales) y que por lo tanto es heredada.

Mutación somática: Mutación que se adquiere en la vida postnatal y que sólo se halla presente en células somáticas. No se hereda.