Jochen Raedle, M.D., Angela Brieger, B.Sc., Jörg Trojan, M.D., Tanja Hardt, B.Sc., Günter Herrmann, M.D., Stefan Zeuzem, M.D. Second Department of Internal Medicine (JR, AB, JT, TH, SZ) and Department of Pathology (GH), Johann Wolfgang Goethe University, Frankfurt / Main, Germany

Las alteraciones de longitud en secuencias repetitivas cortas de ADN, denominada inestabilidad de microsatelites (IM), se utilizan como criterio diagnóstico de errores de replicación (RER) causados por mutaciones en al menos uno de los 5 genes de reparación de errores de apareamiento ("mismatch repair genes" o "MMR genes"). Por lo tanto, el análisis de IM es de gran utilidad en la práctica clínica para la identificación de pacientes con Carcinoma Colorrectal Hereditario Sin Poliposis (CCHSP).
La IM se puede detectar comparando la amplificación selectiva de loci microsatelitarios en ADN extraído de tumores incluídos en parafina y en ADN de sus correspondientes tejidos peritumorales. Este método es laborioso, largo e incluye numerosos pasos, lo cual en algunas ocasiones puede limitar su utilidad clínica.
Este trabajo compara el análisis rápido de Inestabilidad de Microsatélites con un método eficiente y rápido de extracción de ADN basado en preincubación con Triton X-100, contra los métodos convencionales de extracción de ADN para el rastreo de CCHSP en especímenes de carcinoma colorrectal de 12 pacientes.
Se testearon 5 loci microsatelitarios complejos y 2 loci no complejos (CA)_n con análisis fluorescente multicolor con secuenciador automático de ADN. Los dos métodos de preparación de ADN comparados permitieron detectar, por igual, IM y pérdida de heterocigosidad (LOH) en muestras tumorales colorrectales. Sin embargo, el número de extracciones de ADN iniciales no exitosas, a partir de tejidos incluidos en parafina, y la duración total del análisis de IM se reducen sensiblemente cuando se utiliza el método de análisis rápido de IM propuesto en este trabajo.
El fenotipo de error replicativo (RER+) evaluado por IM fue detectado en 2 de 12 pacientes con historia familiar positiva de cáncer colorrectal. El diagnóstico final de CCHSP se confirmó finalmente a través de la detección de la mutación de línea germinal específica en uno de los genes de reparación de errores de apareamiento (MMR genes). El método de análisis rápido de IM aquí descripto es más eficiente y rápido; y en general, reduce el riesgo de contaminación intermuestra, ya que el número de pasos requeridos para el estudio es menor. Por lo tanto, este método podría reemplazar los métodos tradicionales de extracción de ADN para análisis microsatelitario. Además, las técnicas que utilizan reacción de la polimerasa en cadena (PCR) con cebadores (primers) fluorescentes y secuenciadores de ADN semiautomáticos; permiten un rápido y preciso análisis de IM y LOH, independiente del observador.
La combinación de nuestro rápido método de extracción de ADN y el uso de marcadores microsatelitarios altamente específicos pueden mejorar el análisis de errores de replicación (RER) en el rastreo de Carcinoma Colorrectal Hereditario Sin Poliposis.

Este trabajo propone nuevas modificaciones y avances en el método de detección de Inestabilidad de Microsatélites, los cuales apoyados en métodos eficientes de extracción de ADN a partir de tejidos en parafina, sumados a la utilización de secuenciadores automáticos permitirían obtener resultados con mayor rapidez y precisión, de gran importancia en la práctica clínica.
Los Microsatélites son secuencias de ADN de longitud variable (cortas) mononucleotídicas o dinucleotídicas que se repiten un número variable de veces. Los mismos se hallan repartidos en múltiple número de copias en todos los cromosomas y pueden encontrarse dentro o fuera de los genes.
Ej. de microsatélite mononucleotídico: (A)10 (una secuencia de 10 Adeninas repetidas).
Ej. de microsatélite dinucleotídico: (CA)n (una secuencia CA repetida n número de veces, usualmente 15 a 30 veces).
Las secuencias repetidas de 3, 4 o 5 nucleótidos se consideraban "cortas repeticiones en tándem", pero actualmente la diferencia es semántica.
La detección de Inestabilidad de Microsatélites tiene probada utilidad clínica como método de estudio de la funcionalidad del los genes de reparación de errores de apareamiento del ADN o "mismatch repair genes" (MMR genes). Estos genes codifican proteínas que reparan el ADN cuando ocurren errores de apareamiento en la doble hélice del ADN por fallas en la replicación del mismo (lo cual es usual y muy frecuente en secuencias repetitivas). Estas proteínas son fundamentales en la reparación y mantenimiento del ADN en células con gran capacidad proliferativa como las epiteliales, y en especial en el epitelio colorrectal.
Los pacientes que heredan en forma autosómica dominante una mutación en uno de los alelos de los 6 genes de reparación de errores de apareamiento del ADN conocidos hasta ahora (hMLH1, hMSH2, hPMS1, hPMS2, hMSH3 y GTBP / hMSH6), padecen de errores de apareamiento replicativos en el ADN (fenotipo RER +) que se evidencia por Inestabilidad en los Microsatélites. Estos pacientes son heterocigotas para la mutación de un gen MMR dado (tienen un alelo mutado y uno normal), y expresan (fabrican) la mitad de la concentración de una proteína MMR normal (la otra mitad está alterada), respecto de un individuo sano. Por ello, su capacidad funcional de reparar errores en el ADN no está anulada, pero si disminuída, con lo cual la posibilidad de que aparezcan defectos en la secuencia del ADN aumenta.
Recordemos que esta alteración heredada está en todas las células del cuerpo (somáticas y germinales), por lo que se dice que es una mutación en línea germinal.
En estos pacientes, durante la vida postnatal estos errores en el ADN producidos continuamente y no reparados eficientemente (funciona un solo alelo) + la exposición a carcinógenos ambientales, llevan a la alteración del otro alelo del gen MMR que no estaba mutado en algunas células somáticas como las del epitelio colorrectal. A partir de ese momento el paciente tendrá casi todas sus células heterocigotas para un gen MMR (un alelo mutado y uno normal), y algunas células del epitelio colorrectal (por ejemplo) con los dos alelos mutados, es decir homocigota para la mutación. Por ello se dice que esas células perdieron heterocigosidad (se volvieron homocigotas para la mutación), y con ello perdieron totalmente la actividad normal de la proteina MMR en esas células y la capacidad funcional de reparar errores en el ADN.
Estos errores en la replicación del ADN que no se pueden reparar, llevan a la aparición de nuevas mutaciones, que en una secuencia conocida, producen ventajas proliferativas en una población celular, pérdida del control del ciclo celular y transformación maligna con la aparición de carcinomas colorrectales y extracolónicos (ya que lo mismo ocurre en otros órganos).
El sindrome hereditario debido a la falla en los genes de reparación del ADN tipo MMR; cuya clínica y patrón de herencia fueron descriptos originalmente por H. T. Lynch, mucho antes de que se conociera la alteración genética; se conoce con el nombre de Carcinoma Colorrectal Hereditario Sin Poliposis (CCHSP) o Sindrome de Lynch.

Este sindrome se carateriza por:

La detección clínica de la enfermedad a través de los criterios de Amsterdam ampliados, la confección de árboles genealógicos y la confirmación molecular de la patología es de fundamental importancia para el tratamiento y seguimiento de los pacientes afectados y para el screening de sus familiares.
Finalmente, si bien los métodos semiautomáticos de análisis de microsatélites con secuenciador, como los propuestos en este trabajo, son más rápidos y son independientes del observador; los métodos manuales mediante electroforesis en geles de secuencia y detección con plata son muy eficientes e informativos para detectar inestabilidad de microsatélites para observadores entrenados, y requieren un equipamiento de laboratorio menos costoso. Estos métodos manuales son los que se han utilizado por años en todo el mundo para describir la inestabilidad de microsatélites y con ellos debería comenzar un laboratorio de biología molecular de mediana complejidad para la puesta a punto de las técnicas, pudiendo luego evolucionar a la utilización de secuenciadores. Dado los altos costos de estas técnicas en nuestro país, el método actual más accesible es el manual, y es el que nuestro laboratorio ha elegido para llevar a cabo el rastreo de CCHSP en el contexto del Programa de Cancer Hereditario (PROCANHE) de nuestro Hospital, uno de los primeros emprendimientos para la confirmación molecular de esta patología en la Argentina, que ha recibido el valiosísimo apoyo de H.T. Lynch.